DOENÇAS INFECCIOSAS

IMUNOLOGIA – CAPÍTULO SEIS  

GENÉTICA DAS IMUNOGLOBULINAS  

Dr. Gene Mayer
Professor Emeritus
University of South Carolina School of Medine

Tradução:
PhD. Myres Hopkins
 

OBJETIVOS
Descrever a organização e expressão das famílias de genes das imunoglobulinas.
Explicar as origens da diversidade de anticorpos.

Dados de sequenciamento de aminoácidos revelaram que uma única região C pode estar associada com muitas regiões V diferentes. Também foi demonstrado que um único idiotipo pode estar associado com diferentes regiões C (ex. IgM e IgG). Para explicar estes dados foi sugerido que talvez as duas regiões da molécula de imunoglobulina fossem codificadas por genes separados e que as regiões gênicas de V e C fossem de alguma forma ligadas antes que uma molécula de imunoglobulina fosse feita (ou seja, haveria dois genes para um polipeptídeo). Esta foi uma idéia revolucionária mas com o advento da recnologia do DNA recombinante, foi provado ser a correta. As cadeias pesadas e leves das imunoglobulinas são codificadas por três famílias de genes diferentes cada uma situada em um cromossomo diferente – uma para a cadeia pesada e uma para cada um dos tipos de cadeia leve. Cada uma dessas famílias de genes tem algumas regiões gênicas V e uma ou mais regiões gênicas C. As regiões gênicas V e C não são entretanto imediatamente adjascentes uma em relação à outra.

Organização de genes da linhagem germinativa
A organização dos genes de cadeia leve kappa e lambda na linhagem germinativa ou em células indiferenciadas é mostrado na Figura 1.

Cadeias leves  lambda
A família de genes lambda é composta de 4 regiões gênicas C, uma para cada subtipo de cadeia lambda, e aproximadamente 30 regiões gênicas V. Cada região gênica V está composta de dois exons, um (L) que codifica para um peptídeo sinal e o outro (V) que codifica para a maior parte da região variável. A montante (lado 5’) de cada um dos genes C há um exon adicional chamado J (junção). Os exons L, V, J e C estão separados por íntrons (sequências intervenientes não codificadoras).

Cadeias leves Kappa
A família de genes de cadeia leve kappa contém apenas um gene de região C, uma vez que há apenas um tipo de cadeia leve kappa. Há muitos genes de região V (aproximadamente 250) cada um deles tem um exon para o peptídeo sinal e um exon V. Na família de genes κ há vários exons J localizados entre os genes V e C. Todos os exons estão separados por íntrons. 

Rearranjo Gênico e Expressão
À medida que uma célula se diferencia em uma célula B madura que irá fazer uma cadeia leve, ocorre um rearranjo dos vários genes (exons) e o gene começa a ser expressado como mostrado na Figura 2.

Quando a célula se compromete a tornar-se em uma célula B fazendo uma cadeia leve, há o rearranjo dos genes ao nível de DNA de forma que um dos genes V é levado para próximo de uma das regiões J. Isso ocorre através de um evento recombinacional que remove o íntron entre as regiões V e J. A seleção de qual gene V é usado não é totalmente aleatória; há uma certa preferência pelo uso de genes V mais próximos das regiões J. Entretanto, com o tempo todos os genes V podem ser usados de forma que todas as combinações de genes V e regiões J podem ser geradas.

Como consequência deste rearranjo de DNA é que o gene se torna transcricionalmente ativo porque um promotor (P), que é associado com o gene V, é levado para perto de um ativador ou enhancer (E), que está localizado no íntron entre as regiões J e C. Quando a transcrição se inicia a partir do promotor um pré-RNAm é feito que contém sequências das regiões L, V J e C, assim como sequências para os íntrons entre L e V e entre J e C (Veja Figura 2). Este pré-RNAm é processado (splicing) no núcleo e os íntrons remanescentes são removidos. O RNAm resultante tem os exons contíguos L, V J e C.

O RNAm é traduzido no citoplasma e o peptídeo sinal é removido quando a proteína é transportada pelo lúmen do retículo endoplasmático. A cadeia leve é montada com uma cadeia pesada no retículo endoplasmático e a imunoglobulina é secretada via rota normal das proteínas secretoras. A região V da cadeia leve madura é codificada por sequências na região dos genes V e J e a região J e a região C por sequências no gene C.

Organização gênica na linhagem germinativa
A organização dos genes de cadeia pesada é mostrada na Figura 3.

Na família de genes de cadeia pesada há muitos genes C, um para cada classe e subclasse de imunoglobulina. Cada um dos genes C é na verdade composto por alguns exons, um para cada domínio e outro para a região de dobradiça. Na família de genes de cadeia pesada há muitos genes de região V, cada um composto de uma sequência para o peptídio sinal e exon V. Além dos vários exons J, a família de genes de cadeia pesada também contém alguns exons adicionais chamados de exons  D (diversidade). Todos os exons são separados por íntrons como mostrado na Figura 3.

Rearranjos gênicos e expressão
Quando uma célula se diferencia em uma célula B madura que irá fazer uma cadeia pesada, ocorre o rearranjo de vários segmentos gênicos  (exons) e o gene começa a ser expressado como mostrado nas Figuras 4 e 5.

 Figura 5
O pré-RNAm é processado no núcleo e os íntrons remanescentes, incluindo aqueles situados entre os exons nos genes C, são removidos

Quando uma célula se compromete a tornar-se uma célula B fazendo uma cadeia pesada, há dois rearranjos ao nível do DNA. Primeiro, uma das regiões D é levada para perto de uma das regiões J e depois um dos genes V é levado para perto da região DJ rearranjada. Isso ocorre através de dois eventos recombinacionais que removem os íntrons entre as regiões V, D e J. Assim como ocorre com as cadeias leves a seleção do gene V de cadeia pesada não é totalmente aleatória mas eventualmente todos os genes V podem ser usados.

Uma consequência destes rearranjos de DNA é que o gene se torna transcricionalmente ativo porque um promotor (P), que está associado com o gene V, é levado para perto de um ativador (E), que está localizado no íntron entre as regiões J e C_mu. Quando a transcrição se inicia a partir do promor um pré-RNAm é feito que contém sequências das regiões L, V, D, J C_mu e C_delta , assim como sequências para os íntrons entre L e V, entre J e C_mu, e entre C_mu e C_delta (Figura 4).

O pré-RNAm é processado (splicing) no núcleo e os íntrons remanescentes, incluindo aqueles entre os exons nos genes C, são removidos (Veja Figura 5). O pré-mRNA pode ser processado de duas maneiras, uma para levar VDJ para perto do gene C_mu e a outra para levar o VDJ para perto do gene C_delta. Os RNAm resultantes têm os exons L, V, D, J e C_mu ou C_delta contíguos e irão codificar para uma cadeia mu e uma delta, respectivamente.

Os RNAm são traduzidos no citoplasma e o peptídeo sinal é removido à medida que a proteína é transportada pelo lúmen do retículo endoplasmático. A cadeia pesada é montada com uma cadeia leve no retículo endoplasmático e a imunoglobulina é secretada via rota normal das proteínas secretoras. A região V da cadeia pesada madura é codificada por sequências no gene V, região D e região J e a região C por sequências no gene C.

De cada lado dos exons V, J e D há sequências especiais referidas como sequências sinais de recombinação (RSS), que funcionam na recombinação. Cada RSS consiste de um nonâmero conservado e um heptâmero conservado que são separados ou por 12 ou por 23 pares de bases (bp) como ilustrado na Figura 6. Os espaços de 12bp e 23 bp correspondem a uma ou duas voltas da hélice de DNA.

A recombinação só ocorre entre um sinal de 1 volta e um sinal de 2 voltas. No caso das cadeias leves λ existe um sinal de 1 volta a montante (lado 5’) do exon J e um sinal de 2 voltas a jusante (lado 3’) de V_lambda. No caso das cadeias leves κ há um sinal de 1 volta a jusante (lado 3’) do gene V_kappa e um sinal de 2 voltas a  montante do exon J. No caso das cadeias pesadas há sinais de 1 volta em cada lado do exon D e um sinal de 2 voltas a jusante do gene V e um sinal de 2 voltas a montante do exon J. Assim, isso garante que os eventos corretos de recombinação irão ocorrer.

Os eventos de recombinação resultam na remoção dos íntrons entre V e J e no caso das cadeias leves ou entre V, D, e J no caso das cadeias pesadas. O evento de recombinação é catalizado por duas proteínas, Rag-1 e Rag-2. Mutações nos genes para essas proteínas resultam em uma severa doença, a Imunodeficiência Combinada Grave (ambos os tipos de células T e B são deficientes), já que essas proteínas e as RSS estão envolvidas na geração de receptores para antígenos de células B e T.

 Figura 8
Ordem da expressão de Ig – Cadeia leve

Uma célula B individual só produz um tipo de cadeia leve e uma classe de cadeia pesada.(Obs. A única exceção é que uma célula B madura não produz ambas as cadeias pesadas μ e δ mas a especificidade do anticorpo é a mesma uma vez que a mesma região VDJ é encontrada nas cadeias μ e δ). Uma vez que qualquer célula B tem os cromossomos maternos e paternos que codificam para os genes da imunoglobulina, deve haver uma maneira ordenada pela qual uma célula expresse seus genes de imunoglobulina de tal forma que garanta que só um tipo de cadeia leve e uma classe de cadeia pesada seja produzida.

A ordem pela qual os genes de imunoglobulina são expressos em uma célula B é mostrada na Figura 7 e 8.

Cadeia pesada (Figura 7)
Uma célula primeiro tenta rearranjar um dos genes de cadeia pesada; em algumas células o cromossomo materno é selecionado e em outras o cromossomo paterno é selecionado. Se o rearranjo é bem sucedido de forma que uma cadeia pesada é feita, então nenhum rearranjo posterior ocorre nos genes de cadeia pesada. Se, por outro lado, a primeira tentativa de rearranjar os genes de cadeia pesada é mal sucedido (isto é, nenhuma cadeia pesada é feita), então a célula tenta rearranjar os genes de cadeia pesada no seu outro cromossomo. Se a célula não for bem sucedida ao rearranjar os genes de cadeia pesada pela segunda vez, seu destino é ser eliminada.

Cadeia leve kappa (Figura 8)
Quando uma célula rearranja com sucesso um gene de cadeia pesada, ela começa então a rearranjar um dos seus genes de cadeia leve kappa. É  um evento aleatório, quer sejam selecionados genes de cadeia leve maternos ou paternos. Se o rearranjo for mal sucedido (isto é, não produz uma cadeia leve kappa funcional), então ela tenta rearranjar os genes kappa do outro cromossomo. Se uma célula rearranja um gene de cadeia leve kappa com sucesso, ela será uma célula B que faz uma imunoglobulina com uma cadeia leve kappa.

Cadeia leve lambda (Figura 8)
Se uma célula é mal sucedida ao rearranjar ambos os seus genes de cadeia leve kappa, ela então tenta fazer uma cadeia leve lambda. É um evento aleatório, quer sejam selecionados genes de cadeia leve lambda maternos ou paternos. Se o rearranjo é mal sucedido (isto é, não produz uma cadeia leve lambda funcional), então ela tenta rearranjar os genes lambda no outro cromossomo. Se uma célula rearranja com sucesso um gene de cadeia leve lambda, ela será uma célula B que faz uma imunoglobulina com uma cadeia leve lambda.

A sequência ordenada dos rearranjos nos genes de imunoglobulina explica:

• Porque uma célula B individual só pode produzir um tipo de imunoglobulina com um tipo de cadeia pesada e um tipo de cadeia leve.
   
• Porque uma célula B individual só pode fazer anticorpos de uma especificidade.
   
• Porque há exclusão alélica em alotipos de imunoglobulina a nível de uma molécula de imunoglobulina individual mas há expressão co-dominante de alotipos no organismo como um todo.
   

Generalidades
Diversidade de anticorpos se refere à soma todal de todas as especificidades  de anticorpos que um organismo pode fazer. É istimado que podemos fazer 10⁷ - 10⁸ moléculas diferentes de anticorpos. Uma das mais importantes questões em imunologia tem sido como podemos fazer tantas moléculas de anticorpos diferentes. As teorias que têm tentado explicar a origem da diversidade de anticorpos caem em duas categorias principais.

• Teoria da linhagem germinativa
  Esta teoria afirma que nós temos um gene de região V diferente para cada anticorpo que podemos fazer.
   
• Teoria da mutação somática
  Esta teoria afirma que nós temos um ou poucos genes de região V e a diversidade é gerada por mutações somáticas que ocorrem nesses genes.

Idéias Atuais
Nosso pensamento atual é de que tanto a teoria da linhagem germinativa como a teoria da mutação somática têm algum mérito. Acredita-se que a diversidade de anticorpos seja gerada pelos seguintes mecanismos.

1. Um grande número de genes V

Existem:

a) 30 genes V de lambda
b) 300 genes V de kappa
c) 1000 genes V de cadeia pesada

2. Junção V-J e V-D-J
A região onde o gene V de cadeia leve e a região J ou o gene V de cadeia pesada e as regiões D e J se unem é na terceira região hipervariável. Uma vez que é imprevisível qual região V e quais regiões J ou D irão se juntar, há muita diversitade que pode ser gerada pela junção V-J e V-D-J.

3. Diversidade juncional (Inacurácias na recombinação V-J e V-D e D-J) - (Figura 9)

A recombinação entre V-J e V-D-J nem sempre é perfeita e diversidade adicional pode existir devido a êrros que ocorrem no evento de recombinação que leva a vegião V para perto das regiões J ou D ou a região D para perto da região J. É estimado que essas inacurácias possam triplicar a diversidade gerada pela junção V-J e V-D-J. A diversidade gerada por esses mecanismos ocorrem na terceira região hipervariável e portanto, afetam diretamente o sítio de recombinação do anticorpo.

4. Inserção na região N
Na junção entre os segmentos D e J há frequentemente uma inserção de uma série de nucleotídeos que é catalizada pela enzima transferase terminal. A transferase terminal cataliza a polimerização aleatória de nucleotídeos no DNA sem a necessidade de uma fita molde. Isso leva a mais diversidade na terceira região hipervariável.

5. Mutação somática
Há evidência de que mutações somáticas ocorrem no gene V, particularmente no local que codifica para a segunda região hipervariável. Assim, mutação somática provavelmente contribui para a diversidade de anticorpos até certo ponto.

6. Associação combinatorial
Qualquer célula B individual tem o potencial de fazer qualquer uma das possíveis cadeias pesadas e qualquer uma das possíveis cadeias leves. Assim, diferentes combinações de cadeias pesadas e leves em uma célula B individual adiciona mais diversidade.

7. Multi-especificidade
Devido a reações cruzadas entre determinantes antigênicos de estrutura similar um anticorpo pode frequentemente reagir com mais de um determinante antigênico. Isso se chama multi-especificidade. Multi-especificidade também contribui para a diversidade de anticorpos.

Um exemplo de como estes mecanismos podem gerar uma grande quantidade de diversidade é ilustrado abaixo:

Estes cálculos não levam em consideração as contribuições das cadeias leves lambda, mutação somática, diversidade juncional, inserções na região N ou multi-especificidade.

O processo de rearranjo gênico das cadeias pesadas e leves e a associação combinatorial dessas cadeias ocorre durante o desenvolvimento da célula B e é independente de antígeno. Clones de células B expressando todas as possíveis especificidades de anticorpos são produzidos durante o desenvolvimento e antígeno simplesmente seleciona aqueles clones que têm o receptor apropriado. Os clones selecionados são então ativados, proliferam e se diferenciam em plasmócitos secretores de anticorpos.

RECEPTOR DE CÉLULA T PARA ANTÍGENO

Células T também têm um receptor para antígeno em suas superfícies. Este receptor não é uma molécula de imunoglobulina mas é composto de duas cadeias polipeptídicas diferentes que têm regiões contantes e variáveis análogas às das imunoglobulinas. A diversidade no receptor de célula T também é gerada da mesma maneira como foi descrita para a diversidade de anticorpos (ex. por junção VJ e VDJ dos segmentos de genes e associação combinatorial). Entretanto, nenhuma mutação somática tem sido observada em células T.

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