DOENÇAS INFECCIOSAS

VIROLOGIA – CAPÍTULO QUATRO  

ESTRATÉGIAS DE REPLICAÇÃO DE VIRUS DE RNA    

Dr Margaret Hunt
Professor Emerita
Department of Pathology, Microbiology and Immunology
University of South Carolina School of Medicine

Tradução: PhD. Myres Hopkins

En Español

OBJETIVOS

Análise descritiva das estratégias replicativas empregadas por vírus de RNA animais

Identificação de protótipos virais associados com esquemas de replicação de diferentes tipos de vírus de RNA

Estrutura do Pólio Tipo 1 Mahoney. Dados de raios-X de Hogle et al.(Univ. de Harvard), entrada de 2PLV no PDB, renderizado com GRASP (A.Nicholls, Columbia Univ.). Cortesia do urtesy of Dr Sgro e do Institute for Molecular Virology, Univ. de Wisconsin  (usado com permissão)

Vírus de RNA que copiam seu RNA em DNA

Esses são os retrovírus. Nesse caso, seus virions de RNA, embora de sentido positivo, não funcionam como RNAm imediatamente após a infecção, visto que ele não é liberado do capsídeo para o citoplasma. Ao invés disso, ele serve como um template para a transcritase reversa e é copiado em DNA. A transcritase reversa não está disponível na célula, e assim esses vírus necessitam codificar para esta enzima e empacotá-la nos virions.

 

O PROBLEMA DA TRADUÇÃO

A maquinária de tradução ou síntese protêica da célula hospedeira eucariótica em geral usa RNAm monocistrônicos e assim existe um problema ao fazer mais de um tipo de proteína a partir de um único RNAm.

Vírus de RNA têm algumas soluções para este problema:

• O vírus faz RNAm múltiplos monocistrônicos
• O vírus faz transcritos primários que são processados pela maquinária de splicing do hospedeiro para fazer mais de um RNA monocistrônico
• O RNAm viral age como um transcrito monocistrônico. Um grande polipeptídeo (chamado de poliproteína) é feito, que é então clivado em proteínas separadas – Assim, um produto de tradução inicial é processado para produzir proteínas múltiplas. Isso acontece, por exemplo, em picornavírus
• O RNAm viral tem características especiais que permitem ribossomos se ligarem internamente, ao invés de (ou também) no terminal 5’.

TAMANHO DO GENOMA DE VÍRUS DE RNA

Vírus de RNA tendem a ter um genoma relativamente pequeno (embora o tamanho do virion não seja necessariamente pequeno). Isto é provavelmente porque a falta de mecanismos de correção de erros de RNA ponha um limite no tamanho dos genomas de RNA.

A consequência de ter um genoma pequeno é que vírus de RNA tendem a codificar para apenas algumas proteínas. Estas incluem a polimerase que pode copiar em um ácido nucleico complementar (quer seja RNA, ou no caso de retrovírus, DNA) e uma proteína de ligação viral.

Figura 2 Vírus da pólio x350,000 © Dennis Kunkel Microscopy, Inc.  Usado com permissão  

Exemplos: 

·         picornavírus

·         togavírus

·         flavivírus

PICORNAVÍRUS   (PICORNAVIRIDAE)

Propriedades

São vírus pequenos (28nm), nús icosaédricos (figura 1)  (pico=muito pequeno). O RNA é de fita simples, sentido positivo, poliadenilados. Ele funciona como RNAm imediatamente após a infecção.

Membro protótipo: poliovírus (figura 1 e 2)

Adsorção e penetração

Uma proteína viral reconhece um receptor na membrana celular do hospedeiro (é importante para o tropismo do vírus).
Parece que a ligação ao receptor altera a estrutura do capsídeo de alguma forma, um canal é formado através da membrana celular e o RNA é liberado no citoplasma. O RNAm está agora disponível para a tradução.
 

Síntese de proteínas virais

O RNA do virion do poliovirus funciona como um RNAm mas não tem a estrutura cap medilada típica de RNAm eucarióticos – ele tem uma “pista de pouso do ribossomo” (conhecida como sítio de entrada interna do ribossomo ou IRES) que habilita os ribossomos a se ligarem sem ter que reconhecer uma estrutura 5’ cap medilada (figura 3).

Picornavírus frequentemente interferem no reconhecimento do cap metilado da célula hospedeira. A maioria das traduções de células hospedeiras são dependentes de cap, assim é inibida muita síntese protêica do hospedeiro, mas não a síntese protêica viral – uma maneira pela qual esses vírus podem modificar a célula hospedeira em seu favor.

O RNAm é traduzido em um único polipetídeo (poliproteína), que é clivado. As clivagens ocorrem antes que a tradução seja terminada (ou seja, na cadeia nascente (= em crescimento) e são realizadas por proteases codificadas pelo vírus (figura 4). Algumas dessas proteases podem funcionar mesmo enquando são parte da poliproteína.

Os produtos da clivagem inclui:

Uma RNA polimerase (replicase)
Componentes estruturais das proteases do virion 

Replicação do RNA

Nós agora fizemos proteínas virais novas para apoiar a replicação.

1. A RNA polimerase viral copia RNA genômico sentido positivo em RNA complementar sentido menos:

Este processo necessita:

VPg (ou precursor contendo VPg)
RNA polimerase viral (replicase)
Certas proteínas hospedeiras virais

VPg age como um primer para a síntese de RNA, o que explica por que ele está no terminal 5’ de todas as moléculas de RNA recentemente sintetizadas.

2. Fitas novas sentido menos servem de template para novas fitas sentido positivo (figura 5). Novamente, RNA polimerase e VPg de poliovírus são necessárias. VPg está ligada aos terminais 5’ das fitas novas sentido positivo (repetindo, elas provavelmente funcionam como primer).

A nova fita positiva tem três destinos alternativos:
i. Pode servir como um template para mais fitas menos
ii. Pode see empacotada na progênie de virions
iii. Pode ser traduzida em poliproteína (Neste caso VPg é normalmente removida antes da tradução)
 

Montagem

Quando é acumulada uma progênie de RNA sentido mais e proteínas do virion suficiente, começa a montagem. As partículas são montadas com VPg-RNA dentro e 3 proteínas no capsídeo [VP0,1 e 3]. VP0 é então clivada a VP2 e VP4 à medida que os virions maturam e esses virions maduros são infecciosos. Virions são liberados após a lise celular. Excessos de capsídeos são formados e corpos de inclusão podem ser vistos no citoplasma.

NOTE: O CICLO INTEIRO OCORRE NO CITOPLASMA

NÃO HÁ DIVISÃO EM EXPRESSÃO GÊNICA INICIAL E TARDIA

 

VÍRUS NÃO SEGMENTADOS DE FITA NEGATIVA

Exemplos: 

• Rabdovírus (figura 6)

• Paramixovírus (figura 11)

 

Figura 7b
Vírus da raiva brotando de um corpo de inclusão  (corpúsculo negro) para o retículo endoplasmático em uma célula nervosa.  A. Corpo negro. B. Notar o RNP abundante na inclusão. C. Vírus da raiva em brotamento. CDC

Exemplo: Vírus da raiva. O membro mais intensivamente estudado é o vírus da estomatite vesicular.

RNA: 

·         é de fita simples

·         é de sentido negativo (menos)

·         codifica para 5 proteínas
 

Ligação, penetração e desnudamento

O vírus adsorve à superfície celular.
A glicoproteína G é a proteína de ligação (figura 7) que se liga a um receptor na superfície da célula hospedeira.
O vírus ligado é captado por endocitose.
A membrana do vírus se fusiona com a membrana do endossomo (o pH ácido do endossomo é importante porque a proteína G necessita ser exposta a pH ácido para poder facilitar a fusão.
Como resultado da fusão da membrana viral com a do endossomo, o nucleocapsídeo é liberado no citoplasma.
 

Transcrição

'Transcrição' é usado neste contexto para se referir à síntese de RNAm.
O desnudamento completo do nucleocapsídeo não é necessário para a transcrição – a RNA polimerase do virion pode copiar o RNA do virion quanto ele está na sua forma nucleocapsídica. Isso é uma vantagem no sentido de que o RNA genômico fica um pouco mais protegido de ribonucleases.
Há um RNAm monocistrônico para cada uma das cinco proteínas codificadas pelo vírus (figura 8). Os RNAm recebem o 5’ cap, é metilado e poliadenilado. Visto que é um vírus de RNA de sentido negativo citopasmático, as enzimas da síntese de RNA e modificação estão empacotadas no virion.
 

Tradução

RNAs mensageiros são traduzidos nos ribossomos hospedeiros e todas as cinco proteínas virais são feitas ao mesmo tempo. Não há distinção entre funções iniciais e tardias.

Replicação do RNA

A replicação do RNA é o processo pelo qual novas cópias do comprimento do genoma de RNA são feitas (figura 8).
A replicação do RNA ocorre no citoplasma e é realizada pela RNA polimerase viral.
A fita mais é coberta em todo o seu comprimento por proteínas do nucleocapsídeo à medida que é feita (RNAm não são cobertos com esta proteína, o que poderia interferir na maquinária de tradução de proteínas hospedeiras).

A nova fita positiva é copiada em uma fita menos completa, que é também coberta por proteínas do nucleocapsídeo à medida que é feita. (Note: visto que a RNA polimerase viral sintetiza RNAm (transcrição) e toda a extensão do RNA (replicação), ela é às vezes chamada de transcritase ou replicase, sendo que tais nomes focalizam diferentes aspectos da atividade da polimerase).

A fita negativa nova pode:

i. ser usada como template para a síntese de mais fitas mais inteiras
ii. ser usadas como templates para a síntese de mais RNAm
iii. ser empacotadas em virions

Montagem

O vírus consiste de dois "módulos" – o envelope e o nucleocapsídeo:

Envelope
Proteínas transmembrana são feitas nos ribossomos ligados ao retículo endoplasmático. Elas são inseridas no retículo endoplasmático à medida que são feitas, glicosiladas no retículo endoplasmáttico e passam através do corpúsculo de Golgi, onde modificações substanciais das cadeias de carboidratos ocorrem. Elas são então transportadas em vesículas para a membrana celular apropriada; no caso do vírus da estomatite vesicular, esta é a membrana plasmática (figura 9).

Nucleocapsidio
A síntese do nucleocapsídeo foi descrita acima. O complexo da RNA polimerase viral associa com os nucleocapsídeos a medida que eles são formados. Nucleocapsídeos brotam através de áreas modificadas da membrana que contém proteínas G e M (figura 10). A proteína M (matriz) está envolvida na montagem – ela interage com regiões de G na membrana e com nucleocapsídeos.

NOTE:

·         O CICLO DE VIDA INTEIRO OCORRE NO CITOPLASMA

·         A RNA POLIMERASE E ENZIMAS DE MODIFICAÇÃO DO RNA SÃO CODIFICADAS PELO VÍRUS E ESTÃO PRESENTES NO VIRION

NÃO HÁ DIVISÃO ENTRE INICIAL E TARDIO

 

Paramixovírus (figura 11) são pleomórficos, ou seja: há muitas formas morfológicas do vírus em uma população. Eles têm RNA de sentido negativo, não segmentado e um nucleocapsídeo helicoidal (figura 12). Eles são envelopados, isto é, eles são arrodeados por uma membrana derivada de uma célula hospedeira.
O envelope contém duas glicoproteínas codificadas pelo vírus: A proteína F e a proteína de ligação

• A proteína F tem atividade de fusão

• A proteína de ligação se liga a receptores na célula hospedeira
  Esta proteína pode ter:
  Atividade hemaglutinante e atividade de neuraminidase (proteína HN) ou atividade hemaglutinante sozinha (proteína H) ou nenhuma (proteína G).

Hemaglutinação

Hemaglutinação é fácil de testar em um laboratório clínico e é usada no diagnóstico. 

A hemaglutinação envolve a aglutinação de células vermelhas do sangue e se baseia na capacidade de um vírus de se ligar a receptores nas células vermelhas sanguíneas. Visto que vírus têm múltiplas proteínas de ligação por virion, elas podem se ligar a mais de uma célula vermelha e assim eles podem servir para ligar essas células vermelhas em uma malha. Vírus inativados ainda podem hemaglutinar se as suas proteínas de ligação estiverem intactas.

Se alguma pessoa tem anticorpos para uma hemaglutinina viral, os anticorpos irão se ligar à proteína de ligação e impedir sua ligação às células vermelhas do sangue. O soro daquela pessoa irá inibir a reação de aglutinação pelo vírus para o qual ela tem anticorpos – mas não por outros vírus hemaglutinadores. Isso pode ser usado para determinar a qual o vírus hemaglutinador a pessoa foi exposta.

Hemadsorção

Durante a infecção, a proteína de ligação viral será inserida na membrana plasmática da célula infectada. Se a proteína de ligação viral puder se ligar a células vermelhas do sangue, a célula infectada irá se ligar a células vermelhas do sangue porque elas têm a proteína de ligação viral na sua superfície – isso é chamado de hemadsorção. No laboratório clínico, isso pode fazer com que células infectadas por vírus sejam detectadas em um estágio inicial da infecção, e pode permitir a detecção de vírus que não danificam a célula de maneira visível.

Adsorção e penetração

A proteína H(N)/G reconhece receptores na superfície celular.

A proteína F facilita a fusão entre membranas em pH fisiológico, e embora paramixovírus possam ser captados por endocitose, eles também frequentemente entram na célula por fusão direta com a membrana plasmática (figura 13).

Devido à proteína F funcionar em pH fisiológico, isso pode resultar na formação de um sincício sendo formado em infecções por paramixovírus (ver discussão sobre consequências da fusão em pH fisiológico em vírus de DNA – estratégias de replicação – vírus do herpes).

Transcrição, tradução e replicação do RNA

Eventos no interior da célula são muito similares ao rabdovírus (figura 14):

·         A multiplicação viral ocorre no citoplasma.

·         A RNA polimerase viral usa o nucleocapsídeo como template.

·         A RNA polimerase não necessita um nucleocapsídeo totalmente coberto.

·         RNAm virais são transcritos; eles recebem o cap, são metilados e poliadenilados.

·         Visto que é um vírus de RNA de fita negativa, a RNA polimerase e enzimas de modificação do RNA são empacotadas no virion.

·         Os RNAm virais são traduzidos para produzir proteínas virais.

·         Não há distinção entre funções iniciais e tardias na expressão gênica.

Replicação de RNA viral envolve a síntese de todo o comprimento da fita mais. Ela é usada como template para uma fita de todo o comprimento sendo menos. Ambas as fitas de comprimento completo são cobertas com proteína do nucleocapsídeo à medida que elas são feitas (figura 14).

Fitas novas menos de comprimento completo podem servir como templates para a replicação, ou templates para a transcrição, ou elas podem ser empacotadas em novos virions.

 

Figura 16 Ortmixovírus (Influenza A) © Dr Linda Stannard, Universidade da Cidade do Cabo, África do Sul

Montagem

As glicoproteínas virais (proteínas de ligação e proteína F de fusão) são traduzidas como proteínas transmembrana e transportadas para a membrana citoplasmática.
A proteína M (matriz) habilita nucleocapsídeos a interagir com as regiões da membrana plasmática que têm as glicoproteínas inseridas.
O vírus brota através da membrana.
 

Papel da neuraminidase

Nos paramixovírus que as possuem, a neuraminidase pode facilitar a liberação. Nesses vírus, o ácido siálico aparenta ser uma parte importante do receptor. A neuraminidase remove ácido siálico (ácido neuramínico) da superfície da célula. Assim, como o ácido siálico vai estar bastantee removido da superfície da célula e da progênie de vírions, não haverá receptores funcionais. Assim, a progênie de virions não irá se ligar um ao outro ou à célula de onde eles acabaram de brotar (ou a qualquer outra célula infectada). Eles vão portanto ser capazes de se difundir para longe até encontrarem uma célula não infectada.

A neuraminidase pode também ajudar durante a infecção pois se o vírus se liga a resíduos do ácido siálico no muco, ele não será capaz de se ligar a um receptor de uma célula e infectar esta célula. Mas se o ácido siálico no muco for eventualmente destruído, o vírus será libertado e pode então atingir o receptor na superfície da célula.
 

Ativação da proteína F de fusão

A proteína F necessita ser clivada para poder funcionar facilitando a fusão quando o vírus se liga a outra célula (figura 15). Este é um evento tardio na maturação.

Figura 17 Ortomixovírus (Influenza A) © Dr Linda Stannard, Universidade da Cidade do Cabo, África do Sul

Figura 18 Buniavírus
Das bases de dados do ICTV

Figura 19b   Células de cultura de tecido vero E6 infectadas com arenavirus. A imagem mostra partículas virais extracelulares brotando da superfície da célula. Aumento aprox. 12,000 X.Cortesia da imagem de Cynthia Goldsmith, MS, Atividade Patológica em Doenças Infecciosas, DVRD, NCID, CDC

Exemplos: 

·         Ortomixovírus (figura 16 e 17)

·         Buniavírus (incluem o gênero dos Hantavírus) (figura 18)

·         Arenavírus (figura 19b)

ORTOMIXOVÍRUS     (ORTOMIXOVIRIDAE)

Ha três grupos de vírus da influenza: A, B e C.   O vírus da influenza A é mais intensivamente estudado e influenza A e B são os mais importantes na doença humana.

Vírus da influenza são virions pleomórficos (isto é, eles variam de forma). Eles têm sentido negativo, fita de RNA simpes e um genoma de RNA que é SEGMENTADO. Existem 8 segmentos na influenza A. O nucleocapsídeo é helicoidal (figura 19). Os virions contèm RNA polimerase empacotada dentro da partícula viral

Esse vírus são envelopados e têm duas membranas de glicoproteínas (figura 19):        

• HA – hemaglutinina - Esta é a proteína de ligação e fusão
• NA - neuraminidase - Esta é importante na liberação. Ela remove o ácido siálico de proteínas do vírus e da célula hospedeira

Adsorção e penetração

O vírus adsorve a receptores na superfície da célula e é internalizado por endocitose. Em pH ácido de um endossomo, HA realiza uma mudança conformacional e ocorre a fusão. Os nucleocapsídeos são liberados no citoplasma.

Transcrição, tradução e replicação

Nucleocapsídeos são transportados para o núcleo. A síntese de RNAm e replicação do RNA viral ocorre no núcleo. Isso é muito incomum para um vírus de RNA. O vírus da influenza tem um mecanismo não usual de adquirir um terminal 5’ cap metilado para o seu RNAm.

Uma endonuclease viral (que é empacotada no vírus da influenza) desliza do terminal 5’ de um RNAm hospedeiro capeado e metilado cerca de 13-15 bases a partir do terminal 5’ e usa isso como um primer para a síntese do RNAm viral (figura 20) – portanto, todos os RNAm do vírus da influenza têm um pequeno trecho no terminal 5’ que é derivado do RNAm hospedeiro.

A RNA polimerase viral (transcritase) se extende do primer e copia o template em RNAm complementar sentido positivo e adiciona uma cauda poli-A. A transcrição resulta em 8 transcritos primários, um transcrito por segmento. Alguns segmentos originam transcritos primários que podem ser submetidos a splicing alternativo (visto que a síntese do RNA do vírus da influenza ocorre no núcleo, ele tem acesso à maquinária de splicing), cada um originando dois transcritos alternativos. Por exemplo, o seggmento M origina dois RNAm alternativos. Estes codificam para a proteína M1 e a proteína M2. Assim, um único segmento pode codificar para mais de uma proteína pois o vírus tem acesso à maquinária de splicing. Os RNAm são traduzidos no citoplasma. Proteínas transmembrana se movem para a membrana plasmática enquanto proteínas necessárias para a replicação do RNA são transportadas para o núcleo.

Replicação do RNA

A replicação do RNA ocorre no núcleo usando uma enzima codificada pelo vírus (esta pode ser a mesma que a da RNA polimerase envolvida na transcrição de RNAm, ou uma versão modificada). Um cópia completa exata complementar do RNA do virion é feita – este RNA sentido positivo é provavelmente coberto com proteína do nucleocapsídeo enquanto é feito. Um RNA fita positiva completo é então usado como template para a síntese de uma fita completa sentido negativo; novamente a nova fita menos é provavelmente coberta com proteína do nucleocapsídeo enquanto ele é feito. Novas fitas menos podem ser usadas como templates para replicação, síntese de RNAm, ou empacotadas.

Montagem

Isso ocorre na membrana plasmática. Nucleocapsídeos são transportados para fora do núcleo wnquanto proteínas do envelope são transportadas via corpúsculo de Golgi para a membra citoplasmática. A proteína M1 interage com o nucleocapsídeo e com uma região modificada da membrana plasmática que contém as glicoproteínas HA e NA. Os virus então brotam através da membrana celular hospedeira.

NOTE:  

·         HA precisa ser clivada para poder promover a fusão. A clivagem ocorre à medida que o vírus deixa a célula ou no fluido extracelular. A necessidade de clivagem afeta quais os tecidos podem produzir infecções virais. A proteína clivada precisa então realizar uma mudança conformacional, normalmente causada pela exposição a um ambiente endossomal ácido quando ela infecta a próxima célula, para poder fazer a fusão.

·        NA provavelmente ajuda o vírus a deixar a célula removendo o ácido siálico dos receptores. NA também pode ajudar o vírus a penetrar o muco e atingir células epiteliais do trato respiratório ao permitir que ela dissocie dos receptores contendo ácido siálico no muco pela destruição dos mesmos. A neuraminidase não impede o vírus de infectar novas células porque a endocitose é presumivelmente mais rápida do que a remoção do receptor.

Há similaridades e diferenças entre a família dos Paramixovírus e dos Ortomixovírus. Membros de ambas as famílias são envelopados, ambos contêm fita simples de RNA sentido negativo, têm nucleocapsídeos helicoidais. Entretanto, as duas famílias são muito diferentes. NÃO há relação imunológica entre as duas famílias.

FAMÍLIA REOVÍRUS    (REOVIRIDAE)

A família dos Reovírus incluem:

·         os membros do gênero reovírus

·         os membros do gênero rotavírus

·         os membros do gênero orbirírus

·         vírus colorado da febre do piolho

Reovirus têm simetria icosaédrica e um capsídeo multicamada (capsídeo interior e exterior) (figura 22).
O RNA é de dupla fita. Extistem 10-12 segmentos( dependendo do gênero da família de Reovírus da qual pertence o vírus) (figura 22).

Há algumas diferenças significantes no ciclo de vida de membros da família dos reovírus e dos rotavírus. Devido às suas importâncias clínicas em humanos, nós focalizamos em rotavírus.

ROTAVIRUS

(rota = roda (para a aparência de virions no microscópio eletrônico) (figura 23) 

Adsorção, penetração e desnudamento

Ainda não está claro o que exatamente acontece in vivo durante a entrada dos rotavírus na célula. Parece haver uma necessidade de uma protease para remover um pouco da camada externa do capsídeo e para gerar uma “partícula intermediária sub-viral " (ISVP) para que o vírus possa entrar no citoplasma. In vivo, as ISVPs são provavelmente geradas por digestão por proteasee no trato GI. Uma proteína de ligação viral é então exposta no ISVP, provavelmente nos vértices, e se liga a receptores da célula hospedeira. O ISVP ativado entra no citoplasma diretamente ou via endocitose. No citoplasma, o RNA do virion é copiado pela RNA polimerase viral enquanto ainda em um nucleocapsídeo que tem menos proteínas associadas com ele do que estão associadas com o ISVP ou com o virion.

Transcrição e tradução

RNA de fita dupla não funciona como um RNAm e porisso a etapa inicial é fazer RNAm (transcrição).
Os RNAm são feitos por RNA polimerase codificada pelo vírus empacotada no virion. O RNA é capeado e metilado pelas enzimas empacotadas no virion. Ele é então extruído dos vértices do capsídeo.

Os RNAm são traduzidos e as proteínas virais resultantes montam para formar um capsídeo imaturo. Os RNAm são empacotados em capsídeo imaturo e são então copiados dentro do capsídeo para formar RNAs de fita dupla (não se sabe como o vírus garante que cada partícula obtém uma cópia dos 11 RNAm diferentes) (figura 24). Mais RNAs são agora feitos pelos recentemente formados capsídeos imaturos.

Montagem

Mais proteínas são feitas e eventualmente os capsídeos imaturos brotam para o lumen do retículo endoplasmático. Ao fazer isso, eles adquirem um envelope temporário que é perdido à medida que ele matura. Esta é uma característica muito estranha dos rotavírus.

Liberação

Isso provavelmente ocorre via lise celular.

NOTE: O CICLO INTEIRO DE REPLICAÇÃO OCORRE NO CITOPLASMA

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